シークエンス

塩基配列を決定するPCRはシークエンスPCRまたはシークエンスと言います。以前このブログでも説明したように、PCRとは塩基配列があったとして、その中の特定の部分を何回もコピーして増幅する操作のことです。ではこの増幅と塩基配列の決定にどういう関係があるのでしょうか。今回はその原理を解説していきたいと思います。

まずPCRに必要なものをおさらいしておきます。まずは何といっても鋳型となるDNA(テンプレート)です。それと酵素とプライマーも必要となります。これは前回のPCRの説明では触れなかったところですが、PCRにはdNTPを加える必要があります。dNTPとは塩基配列の"塩基"のことで塩基(dNTP)が連なって塩基配列をつくると考えると理解しやすいと思います。NにはA, T, G, Cの四種類あります。したがってdNTPは省略せずに書くとdATP, dTTP, dGTP, dCTPの四種類あるということになります。dNTPはPCRのいわば原料にあたりますから、それが十分量ないとPCRが進まないということは想像に難くないでしょう。

さらにシークエンスを理解するうえでもう一つddNTPについて理解する必要があります。dNTPのdはデオキシを意味します。NTPから酸素が一つとれたという意味です。そしてddNTPのddとはジデオキシを意味します。NTPから酸素が二つとれたという意味です。dNTPは手が二つあり、前の塩基と手をつなぎさらに後ろにも手を伸ばして次の塩基とも結合し塩基の配列を作ることができます。しかしddNTPは手が一つしかないので前の塩基とだけしか手がつなげません。したがってddNTPが塩基配列に加わるとそこで塩基配列が終了してしまい、それ以降伸長が起きなくなります。これがシークエンスの原理の肝となります。

シークエンスでは鋳型となるDNAとプライマーを一種類だけ、そしてdNTPと少量のddNTPを混ぜてPCRの時と同じようにdenaturation, annealing, extentionのサイクルでサーマルサイクラーにかけます。この条件でPCRをかけますとdNTPを原料としながらDNAの伸長が進み、あるところでddNTPが原料として混入することで伸長が終わるということが繰り返されます。すると何が起こるかというと、プライマーから一つ目の塩基がddNTPになるDNA鎖もあれば、1000bpも伸長が続いてやっとddNTPが結合することで伸長が終わるようなDNA鎖もあり、様々な長さのDNAが存在することになります。シークエンスでは普通のPCRと違って特定の塩基配列を増幅するというよりもむしろ、いろいろな長さのDNAを作ることが重要なわけです。これをゲルで流してみましょう。図を見てください。

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一番遠くまでゲルを流れたバンドはプライマーから一塩基目にいきなりddNTP(上の例ではddGTP)が当たって、伸長が一塩基しか行われなかったDNAたちがバンドを作っていると考えられます。一番手前のバンドはプライマーから26塩基目までdNTPが使われたのち27塩基目でddNTP(上の例ではddATP)が当たって伸長が止まったDNAたちが作ったバンドであると考えられます。現在一般的に行われるシークエンスではddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTPがそれぞれ別々の色で蛍光マークされています。そうするとイメージはラダー一本一本が単色で光っているという風な絵が想像できると思います。この蛍光を読み取ることでシークエンスが行われているのです。

実際にはプライマーから近い方の配列は読むことが難しいです。その理由はプライマーから近いところで伸長が止まったDNAは塩基配列が極端に短いので、ゲル泳動したときにバンドとしてきれいに見えないことが原因であると考えられます。プライマーから遠いところでも1kbpとか2kbp先になると今度はシークエンスPCRの過程でそこまで伸長に成功したDNAの数が少なすぎるのでバンドとしてきれいに見えないことが原因で読み取ることはできません。きれいにバンドが見える領域はだいたいプライマーから100bp~1kbあたりでしょう。

ゲルについてですが、シークエンスの場合とても大きいゲルが必要になります。現在はチューブの中にゲルを作ってそこにDNAを流すことによって効率的に配列を読み取ることができるようになっています。チューブといっても細い線のようなもので、板でつくると巨大なゲルになるような長さでもこの方法ならスペースをとりません。

 

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